Tugas Terstruktur 2 Biomol
24 Des 2008 Tinggalkan sebuah Komentar
Garis Besar Tahapan Kloning dan PCR (Polymerase Chain Reaction) Beserta Aplikasi dan Keterbatasannya
Kelompok 30 :
BIJ006143 FEFI FEBRIANI INDAH SARI
BIJ006145 APRIANA TITIK P.
BIJ006149 CITRA DEWI FEBRIANI
KODE : K30-TD-01
RINGKASAN :
Upaya mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui kloning DNA melibatkan beberapa komponen dan melalui beberapa tahapan tertentu. Komponen kloning DNA antara lain DNA asing, DNA vektor, enzim restriksi, dan enzim ligase serta sel inang. Adapun tahapan-tahapannya, yaitu:
1. DNA asing dipotong dengan enzim restriksi, misalnya BamH1 sehingga mengahasilkan ujung sticky 5’-GATC-3’.
2. DNA vektor (ex: plasmid) juga dipotong dengan enzim restriksi yang sama, sehingga plasmid sirkuler berubah menjadi linier dengan ujung sticky yang sama yaitu 5’-GATC-3’.
3. DNA asing diinsersi ke dalam plasmid kemudian disambung dengan enzim ligase, sehingga menghasilkan berbagai macam produk rekombinan.
4. Plasmid rekombinan dimasukkan kembali ke sel inang E.coli, kemudian plasmid ini bereplikasi dalam sel inang. Hal ini dapat terjadi karena gen asing yang diinsersi tidak mengganggu kemampuan replikasi plasmid. Ketika sel inang membelah maka plasmid rekombinan akan ikut terbagi, sehingga akan dihasilkan koloni rekombinan E.coli dengan masing-masing bakteri mengandung banyak ‘copy’ dari DNA asing.
Gambar 1. Garis Besar Tahapan Kloning DNA
Sumber : Figure 4.16 (Brown, 2002)
Kloning dapat digunakan untuk sequencing DNA, memodifikasi karakteristik biologi organisme dan mensintesis protein-protein penting. Sayangnya, teknik kloning untuk mendapatkan gen target membutuhkan waktu yang lama, dan melewati prosedur yang rumit, khususnya dalam seleksi rekombinannya.
Oleh karena itu, dikembangkan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk melengkapi kloning DNA agar dapat tetap memperoleh suatu fragmen DNA yang diinginkan namun dalam waktu yang lebih singkat. PCR meliputi beberapa komponen yang melalui tahapan-tahapan tertentu. Komponen PCR antara lain untai DNA template, sepasang primer, dNTP serta enzim Taq DNA polymerase thermostabil. Primer yang dibutuhkan untuk menginisiasi sintesis DNA harus dapat mensintesis urutan yang tepat. Tahapan-tahapan PCR secara umum adalah sebagai berikut :
1. Denaturasi
PCR dimulai dengan pemanasan DNA target pada suhu 94 0C, sehingga DNA target akan terdenaturasi dan terpisah menjadi untai tunggal karena putusnya ikatan hidrogen.
2. Annealing
Penurunan temperatur menjadi 50-60 0C menyebabkan bersatunya kembali ikatan hidrogen antar nukleotida untai tunggal DNA target, tetapi juga membuka kemungkinan menempelnya primer pada masing-masing untai tunggal DNA sel target.
3. Polimerisasi
Suhu kembali dinaikkan hingga 72 0C (suhu optimum bagi enzim Taq DNA polymerase thermostabil), sehingga sintesis DNA pun dimulai.
Produk yang dihasilkan dari siklus pertama PCR belum menghasilkan fragmen DNA yang diinginkan, sehingga siklus harus diulang. Setelah siklus ketiga barulah diperoleh fragmen DNA target yang diinginkan. Siklus selanjutnya merupakan perbanyakan dari fragmen DNA target yang telah diperoleh dan biasanya berlangsung hingga siklus ke-30. Kemudian, hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa.
Gambar 2. Tahap awal PCR (Polymerase Chain Reaction)
Sumber : Figure 4.28 (Brown, 2002)
Gambar 3. Sintesis fragmen pendek DNA yang diinginkan
Sumber : Figure 4.29 (Brown, 2002)
Gambar 4. Analisis hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Sumber : Figure 4.30 (Brown, 2002)
PCR dapat digunakan dalam bidang kesehatan untuk mendeteksi DNA virus dan screening sampel DNA manusia untuk penyakit genetik seperti thallasemia dan cystic fibrosa, serta dapat membentuk profil genetik. PCR juga dapat menghasilkan sequence DNA pada spesimen forensik dan arkeologi. Namun, PCR memiliki keterbatasan yaitu primer harus menempel pada posisi yang tepat sehingga urutan basa dari DNA target yang akan diamplifikasi harus diketahui. Hal ini berarti PCR tidak akan bisa dilakukan jika gen atau bagian dari genom tersebut tidak pernah dipelajari sebelumnya. Selain itu, PCR hanya mampu mereaksikan segmen DNA tidak lebih dari 100 kb.
Daftar Pustaka
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.section.6035
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6036
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.section.6064
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6070
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6071
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6072
Diakses tanggal 28 Oktober 2008
Situs terkait
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf [FLASH]
http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/cloning/cloning.swf [FLASH]
Diakses tanggal 28 Oktober 2008
Komentar Terakhir